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聚合酶连锁反应 (polymer chain reaction)，即近来全民耳熟能详PCR，其技术之根本是利用特殊的DNA聚合酶 (具耐受温度变化能力者)，将原本发生在细胞内部的DNA复制系统搬移到试管之中，供给DNA之单体，即脱氧核糖核苷酸，再利用特殊的反应条件 (温度变化循环促使双股DNA分离与重新配对) 加速DNA的复制 (见图1)。这项技术堪称现代分子生物学技术的一大基石，该技术已被广泛应用于基因选殖、基因表现分析、基因分型、基因定序和基因突变等领域。

就基因定序来说，在第一代的双脱氧链终止法中，利用双脱氧核苷酸 (ddNTP) 在3’端因为不具备 -OH基 (或 -OR 基，R为H之等效基团)，导致该ddNTP并入聚合体后无法接受下一个核苷酸单体并入。以图1为例，若第一列右上方之ddTTP并入聚合体后，因其3’端因为不具备 -OH基，聚合体将无法合并下一个核苷酸单体而延长，反应会中止在图1的第二列。不论是第三列的错误并入 (第四列)，或是DNA聚合酶校对能力引发的重新正确并入 (第五列) 都不会发生。

该ddNTP还带有放射性同位素或荧光标记基团 (见图2 )，该不能延长的单股聚合体之后与其他长短不一之不能延长的单股聚合体一起进行电泳以决定待测序列。以图3为例，其序列应为5’-ATGCTTCGGAT-3’。

在90年代末期，学界开发出第二代DNA定序技术，根据对于细节的定义不同，分类上可能有三到五种。但其中的边合成边定序法 (Sequence by Synthesis，SBS) 无疑是其中的霸主。

SBS也是利用PCR的原理，但对所使用之脱氧核糖核苷酸进行了修饰 (见图4)，其中的Tag部分为荧光标记基团 (对四种不同的脱氧核糖核苷酸以不同的色光匹配)、Y是可切断的linker，-OR基团的部分则能够发挥类同于前述ddNTP之「3’端因为不具备 -OH基」的中止并入单股聚合体的效果，然而，此处所选用之 -OR基团可以透过化学反应转变成 –OH，以恢复其接受下一脱氧核糖核苷酸并入。

该修饰的脱氧核糖核苷酸被并入延长的单股聚合体后，反应即被中止。此时，侦测Tag所发出的色光，即可知道并入的脱氧核糖核苷酸是A、T、C、G中的哪一种，纪录后即可切断Y处、释放Tag，并将-OR基团恢复成 -OH，于是单股聚合体又可以再接受下一个修饰的脱氧核糖核苷酸并入。重复上述步骤即可以得到不同的色光纪录，进而达成定序 (见图5)。

哥伦比亚大学 (以下略称为哥大) 拥有以美国专利第9,718,852号 (以下略称为 ’852专利)，Massive parallel method for decoding DNA and RNA，为首的五个专利。具体而言，其内容与核苷酸类似物和使用核苷酸类似物对DNA进行定序的方法有关。

wherein R (a) represents a small, chemically cleavable, chemical group capping the oxygen at the 3′ position of the deoxyribose of the deoxyribonucleotide analogue, (b) does not interfere with recognition of the analogue as a substrate by a DNA polymerase, (c) is stable during a DNA polymerase reaction, and (d) does not contain a ketone group;

wherein the covalent bond between the 3′-oxygen and R is stable during a DNA polymerase reaction;

wherein Y represents a chemically cleavable, chemical linker which (a) does not interfere with recognition of the analogue as a substrate by a DNA polymerase and (b) is stable during a DNA polymerase reaction; and

ii) is incorporated at the end of a growing strand of DNA during a DNA polymer-ase reaction,

v) is capable of forming hydrogen bonds with thymine or a thymine nucleotide analogue.

本案的重点在于对于五碳醣上3’ 端-R基团的种种限制，首先，-R基团的体积必须小，以免干扰或阻止DNA聚合酶将此核苷酸类似物并入单股聚合体 (见 (a)之前段与(b))；其次，具有终止并入反应之能力的-OR基团切除-R基团后必须要转变为-OH基团 (即-R基团是一个可切除的保护基)，以利于下一个核苷酸类似物并入 (见 (a)之后段与iii))；最重要的是，系争请求项以负面排除的方式具体记载了不符以上条件的基团「-R不可为酮基」，在考虑结合氧原子的情况下「-OR不可为甲氧基或酯基」。

负面排除的记载方式有优点也有缺点，优点是于表列排除之特征以外的其他可能性均属请求项主张范围，在claim construction时范围极大；反之，范围极大就意味着受到挑战时的受打击面也极大，因为搜集前述其他可能性之相关先前技术的文献非常容易 (避开表列排除之特征即可)。

2017年，基因定序龙头Illumina公司在PTAB对以 ’852专利为首的五个专利提出IPR，认为基于其提出的先前技术，该等专利不具备进步性。Illumina透过对系争专利之说明书的分析，找到了关于-R基团的突破口，即丙烯基 (allyl group)；相对的，哥大虽以负面排除的方式对请求项进行限制，然而数度在说明书内以丙烯基为例，醉翁之意昭然若揭，Illumina以此为突破口也在情理之中。

Illumina在IPR中提出与进步性相关的先前技术众多，但主要有二，兹分述如下。

此先前技术为钱永健[1]等人所提出的PCT申请之公开内容，其中揭露allyl基团可用于SBS，其连接于氧原子上时，可以防止该 -O-allyl 基团转变为 -OH 基团，产生终止的效果。同时又可以在如此修饰的核苷酸类似物并入单股聚合体之后透过化学手段将allyl 基团切除 (见图7)，将该 -O-allyl 基团转变为 -OH 基团，恢复单股聚合体接受下一个核苷酸 (或核苷酸类似物) 并入的能力。

此先前技术为本次诉讼的争执焦点，为发表于期刊的一篇论文，其中对于各种不同的-R基团进行测试比较，发现allyl 基团可用于SBS，其连接于氧原子上时，可以防止该 -O-allyl 基团转变为 -OH 基团，产生终止的效果。但是，在此核苷酸类似物 (具3’-O-allyl者) 浓度为250 µM的状况下，该终止的效力并不完整。

然而，Metzker并未针对「终止的效力不完整」提出解释 (见图9)，这导致了直观上至少有两种可能性：

(1) 此核苷酸类似物本身就很难合并入单股聚合体中，allyl 基团作为保护基团的效果自然难以发挥，没有合并此核苷酸类似物的部分单股聚合体也就仍然保有接纳核苷酸的能力，造成了终止的效力不完整。

(2) 在人为将 -O-allyl 基团转变为 -OH 基团之前，单股聚合体就自发地接受了下一个核苷酸 (或核苷酸类似物) 并入，造成了终止的效力不完整。

哥大选择就前述可能性(1)进行答辩，主张就Metzker的揭露内容而言3’-O-allyl之核苷酸的终止效力不完整，不适于SBS (见图10及11)。

而illumina则提出观点，认为只要提高3’-O-allyl之核苷酸的浓度就可以克服此核苷酸类似物本身就很难合并入单股聚合体中的问题。

PTAB则基于「就Metzker揭露表格来说，即便3’-O-allyl之核苷酸的终止效力不完整，相较其他核苷酸类似物，其仍具有足够好的效力」(见图 8，其中显示有部分核苷酸类似物根本是毫无效力的)，并引用In re Mouttet案之判决内容「仅仅因为先前技术中存在更好的替代方案，并不代表没那么好的组合不适合用于进步性之判断」(见图 12)

PTAB进一步指出，本领域中具有一般知识者当可了解透过提高核苷酸类似物的反应浓度或延长其反应时间，可以克服终止效力不完整的问题。因此，系争专利不具备进步性。

但是，仍然有一位PTAB的行政法官 (Administrative Patent Judge Worth) 提交了不同意见书，简短地指出「Metzker的揭露内容已足以侵蚀由Tsien所建立之使用3’-O-allyl之核苷酸的动机」。

到这个阶段，哥大的策略已然明朗，走的就是反向教示的路子。哥大指出PTAB在判断以下事项时有所违误：(1) 本领域中具有一般知识者有动机在SBS中使用allyl基团作为保护基；(2) 对于前项具有对成功的合理期待；(3) 对于使用allyl基团之四种核苷酸 (A、T、C、G) 不会误配对具有对成功的合理期待 (这一点其实是在挑战提高核苷酸类似物的反应浓度或延长其反应时间的推论)。哥大的主张千言万语，但总归就是一句话：从事SBS之本领域中具有一般知识者在阅读了Metzker后会被劝退使用allyl基团作为保护基。哥大指出，在该领域中的其他研究人员于Metzker发表后选择了其他非allyl的保护基，堪可左证其论点 (见图 13)。

CAFC指出所谓的反向教示需要明确的阻止 (本领域中具有一般知识者) 实施一技术特征，而哥大未能论证此一明确的阻止(见图 14)。

而且，Metzker也未将以allyl基团作为保护基的实验描述成一种失败，相反地，其直接的揭露3’-O-allyl之核苷酸可以被并入单股聚合体中，根据In re Mouttet案的先例，Metzker的揭露内容并未构成反向教示。最后，CAFC认同PTAB「提高核苷酸类似物的反应浓度或延长其反应时间」的论点，肯认其系争请求项不具备进步性的论点。

在利用先前技术之结合从而判断进步性时，经常被忽略的是「必须将先前技术整体观之」(不可单独拆分技术特征)，这个原则在应用反向教示时可说是得到了最大化，在先前的报导中就已反映出「只要提到反向教示，必定巨细靡遗地检视先前技术」这个现象。

究其根源系反向教示已经建立了完整的法理。第一，先前技术中较佳或优选实施例之存在，并不构成对较广之揭露内容或较不理想之实施例的反向教示 (见于In re Susi案与In re Mouttet案)；第二，单纯揭露替代技术方案，而无「批评、诋毁或以其他方式阻拦」(criticize, discredit, or otherwise discourage) 的话，揭露替代技术方案亦不构成反向教示 (见于In re Fulton案与DePuy Spine, Inc. v. Medtronic Sofamor Danek, Inc.案) 。这两点都必须藉由全面审视先前技术来达成，或可称为反向教示正反两面之定义。

然而，理想很丰满，现实很骨感，即便有了正反两面定义，反向教示在应用时仍然让许多人迷茫与纠结，以本案来说3’-O-allyl之核苷酸的「incomplete termination」与其他「complete termination」之实施例并存时，确实符合前段第一个原则。但「incomplete termination」是否构成「批评、诋毁或以其他方式阻拦」就见仁见智了。至少以笔者的个人经验，从事实验室工作时，若是挑了个已知反应不完全的反应物，怕是会收到不少来自学长姐与指导教授的关爱眼神。

钱永健先生为当代分子生物学巨擘，曾获2008年诺贝尔化学奖。钱氏家族中亦诞生数位学术大家。
此处所记载之Allyl ethers，并非allyl-O-allyl之构型，而应为核苷酸之五碳醣-3’-O-allyl。